유전성 난청의 진단과 치료

유전자 치료 모델을 선택하는데 있어 난청을 일으키는 유전 형태, 즉 변이로 영향을 받은 단백질의 기능 변화의 본질을 고려할 필요가 있다. 상염색체 열성 유전형질의 경우 대부분 영향을 받은 단백질의 기능을 부분적으로 또는 완전히 잃게 되는 기능 손실(loss of function) 변이가 발생한다. 이는 유전자 변형으로 일부 또는 전체가 제거되거나, 유전자의 발현이 저하되거나, 전사된 단백의 구조를 변경시켜 그 기능을 바꾸게 된다. 반면 상염색체 우성 유전형질의 결과는 기능 손실과 기능 획득(gain of function)이 모두 가능하다. 영향을 받은 allele은 단백의 활성을 증가시키기도 하고, 새로운 기능을 제공하기도 하며, 부적절한 시기나 위치에서 발현을 야기하지만, 일부 유전자의 우성 변이는 기능 손실(loss of function)을 일으키기도 한다. 예를 들면 정상적인 기능을 위해 두 allele에서 만든 단백이 모두 필요한 경우, 한 개의 wild type allele에서 만든 단백만으로는 기능이 부족하여 충분한 유전 산물이 생성되지 않아 변이 형질을 일으킨다. 이런 경우를 haploinsufficiency라고 한다. 또, 우성 형질의 변이 allele이 단백의 구조를 변형시켜 다른 wild type allele에서 만든 단백의 기능을 방해하는 경우가 있는데, 이를 dominant negative라고 하고, 마치 loss of function 변이에서의 표현형과 유사한 형태로 발현된다. KCNQ4 유전자의 변이에 의해 potassium 이온 채널의 기능 저하가 대표적인 예이다.^35–38)

가장 전통적인 유전질환의 치료법으로서 loss-of-function 질환에서의 유전자 발현을 증가시켜 기능을 회복하는 방법이다. 기능을 손실한 유전자 변이의 경우, 수정시켜 정상적으로 작동하도록 만든 cDNA를 표적 세포에 전달하여 변이 유전자를 대체할 수 있다. 이는 열성 유전으로 인한 loss of function 변이 형질을 나타내는 경우에 적합하다. 수정 유전자를 전달하는 시기도 중요한데, 만약 태아의 발달과정에서 중요한 역할을 하는 유전자라면 정상 청각 경로의 발달에 회복 불가능한 지장을 일으킬 수도 있다. 즉, 유전자 대체가 성공적으로 이루어지기 위해서는 변이가 발현될 때까지의 시간적 여유가 필요하고, 특히 성인기에 난청의 진행이 시작된다면 주입된 유전자는 대상자의 일생에 가까운 시간 동안 발현이 유지되어야 한다. 이를 위해서 여러 번에 걸쳐 치료 유전자를 주입하는 방법을 고려해 볼 수도 있다. 우성 유전 형질을 보이는 변이의 경우에는 유전자 대체보다는 다른 접근법을 고려해야 하겠다. 현재까지 유전자 대체를 통해 동물모델에서 난청의 회복을 증명하는 다양한 보고들이 있었고, 현재 전임상 및 임상 초기 단계에서 OTOF 등의 유전자에 대한 유전자 치료법 개발이 연구 중에 있다.³⁹⁾

유전자 침묵은 변이 유전자의 발현을 차단하기 위한 접근법으로 이형 접합 우성형질 변이에 적용할 수 있다. 즉, 변이 allele의 발현을 차단하여 wild type allele의 발현을 방해하지 않는 것만으로도 변이 형질이 나타나는 것을 극복할 수 있게 되는 것이다. 유전자 침묵은 genome, 전사, 전사 후 단계에 모두 적용할 수 있다. 전사 단계에서는 히스톤 단백의 변형을 유도하거나, RNA polymerase 나 transcription factor 같은 전사 복합체와의 결합을 억제시켜 mRNA가 전사되지 않도록 한다. 이를 위해 유전자 가위로 잘 알려진 CRISPR/Cas9 나^40–42) zinc finger 등을 이용해 epigenetic modification을 일으킬 수 있다.^15,16) RNA 가공 과정인 전사후 단계에서 나타나는 RNA interference(RNAi)를 활용하여 유전자 발현을 차단시켜 침묵을 일으킬 수 있다.¹⁷⁾ RNAi는 noncoding RNA가 표적 mRNA를 분해하고 단백 합성을 저해하여 유전자 발현을 조절하는 정상적인 생물학적 과정인데, 이는 mRNA에 상보적인 두 종류의 작은 RNA인 microRNA(miRNA)와 small interfering RNA(siRNA)를 통해 이루어진다. miRNA 와 siRNA가 표적 mRNA를 조절하는 방식은 매우 유사하지만, 기원이 다르다는 차이가 있다. miRNA가 긴 단일가닥 RNA로부터 기원하는 반면, siRNA는 외부유래 바이러스나 내부 유래 DNA로부터 두 가닥의 RNA(dsRNA)로부터 기원한다. 둘 다 결국 RNA induced silencing complex(RISC)라고 하는 리보단백질 복합체를 구성하여 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 분해하거나 번역을 저해시킨다. RNAi는 진핵세포내에 정상적으로 존재하는 표적 특이적인 반응으로, wild type이나 off target sequence에 영향을 주지 않고 선택적으로 dominant 변이 서열을 조작할 수 있다.^43,44) 유전성 난청에서는 anti-sense oligonucleotide(ASO)에 의한 돌연변이 유전자 침묵을 이용한 난청 개선 효과가 어셔증후군 동물모델에서 여러 차례 증명된 바 있다.^45,46)

유전자 편집 기술이 발달하면서 내이 안에서 직접 정확하게 유전체를 조작하는 연구법이 부상하고 있다.⁴⁷⁾ 이는 Nuclease에 기반한 효소를 조작하여 단일 또는 이중가닥의 DNA가 표적 유전체에 찾아가 도입된 다음 세포내에 내재되어 있는 DNA 복구를 일으키는 방식이다. 세포내에서 DNA 복구는 비상동성 말단연결(nonhomologous end-joining, NHEJ)과 homology-directed repair(HDR) 두가지 방식으로 이루어진다. NHEJ는 비특이적이고 무작위로 small indel의 손상을 복구시켜 frameshift나 premature stop sequence, 단백의 truncation을 일으킬 수 있다. 반면, HDR은 내부 혹은 외부에서 유래한 주형(template)에 따라 특정한 DNA 손상부위를 복구한다. 이를 이용해 고유한 유전자 서열을 정확하게 조작할 수 있고, 심지어 DNA를 부수지 않고도 직접적인 변성(mutagenesis)을 일으킬 수 있다.⁴⁸⁾ 유전자 편집을 위해서는 Zinc finger, TALENs, meganucleases, CRISPR/Cas9 등이 이용된다.^49–52) 2012년 세균의 적응면역에 관여하는 CRISPR/Cas9가 유전자 가위로 발표된 이후, Zinc finger, TALENs, meganucleases 등의 기존 단백질을 이용한 기술보다 획기적으로 간편하고, 표적 서열을 찾는데 필요한 guided RNA(gRNA)가 20 bp로 매우 작아 손쉽게 유전자 조작이 가능해졌다. 또한 CRISPR/Cas9는 하나의 세포에 동시에 여러 개의 유전자를 공략하기 위해 여러 개의 gRNA를 전달시켜 다중화(multiplexing)할 수도 있다.⁵³⁾ 이러한 공로를 인정받아 2020년에는 연구자들이 노벨화학상을 수상하기도 하였다. Cas nuclease가 표적 부위에 찾아가기 위해서는 절단부위에서 3~4 bp 아래쪽 표적주형의 반대가닥에 존재하는 짧은 protospacer adjacent motif(PAM)이 필요한데, PAM 특이성을 수정한 CRISPR nuclease의 발전에 힘입어 off target activity를 감소시키며 유전자 조작이 더욱 정확해지고 있다.^54,55) 최근에는 David Liu 등에 의해 특정 핵산을 치환할 수 있는 유전자 가위, 즉 base editor 및 prime editor 등이 개발되어 유전질환의 새로운 치료법을 제시하고 있다.⁵⁶⁾

생체 내 조직으로 유전물질을 전달하기 위해 다양한 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터가 개발되었다. 대부분의 바이러스 벡터는 복제기능이 없고, 질병이 유발되지 않으며, 캡시드 내에 치료를 위한 DNA를 탑재하기 위해 고유한 유전체의 일부가 삭제된다. 모든 바이러스 벡터는 유전물질의 전달 능력과 발현 유지 기간에 한계가 있으므로 전달 벡터의 선택은 유전자 치료 결과에 영향을 미치게 된다. 하지만 벡터의 종류 자체보다는 치료의 질적인 요소가 결과에는 더욱 중요하다.

Lentivirus벡터(LV)는 Retroviridae 계열로 human immune deficiency virus type 1이나 feline immunodeficiency virus를 기반으로 한다. 최대 8 kb의 외부 DNA를 수용할 수 있을만큼 적재력이 뛰어나고, 분열하거나 분열하지 않는 세포 모두에 효율적으로 유전물질을 전달할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 LV는 코르티기관 내 유모세포에 대한 표적능력이 다소 부족한 것 , in vivo 실험에서 발달 중인 otocyst에 LV를 주입하였을 때 외유모세포와 지지세포에서 약한 유전체 전달이 관찰되었고, 내유모세포에서는 발현이 검출되지 않았으며,⁵⁷⁾ 성인 기니피그의 와우내로 LV를 관류시켰을 때에도 외림프공간에 제한적으로 발현되었으며,⁵⁸⁾ 정원창을 통해 주입시에도 유사한 결과를 보이는 한편,⁵⁹⁾ 청력을 손상시키는 cochleaostomy 후 내림프에 주입시에야 stria vascularis, 코르티기관, 나선신경절에 발현이 유도 되었다.⁶⁰⁾

Adenovirus(AdV)는 Adenoviridae 계열이며, 36 kb의 이중가닥 DNA를 포함한다. 분열하거나 분열하지 않는 세포를 포함하여 다양한 종류의 세포를 감염시킬 수 있고, 높은 강도로 장기간 도입 형질을 발현시킬 수 있어 유망한 벡터로 손꼽힌다.⁶¹⁾ 또한 AdV 고유 유전자를 삭제하여 최대 36 kb까지 유전물질을 적제할 수 있고, 면역반응을 현저히 낮춰 유전자 발현을 더욱 연장시킬 수 있다.⁶²⁾ 내이 세포에서 AdV에 대한 감수성은 coxsackievirus, adenovirus receptor와 ανβ3/ανβ5 integrin 의 co-receptors 존재 여부에 따라 결정되며,⁶³⁾ 외림프 또는 내림프 공간에 AdV 관류시 공간내의 세포에서 발현이 된다.⁶⁴⁾ 인간의 전정 상피세포 배양조직에서도 1세대와 2세대 AdV type 5는 유모세포와 지지세포 모두를 효율적으로 표적화 하였고,⁶⁵⁾ lateral epithelial ridge에 Math1(Atoh1) 전사인자 전달을 성공,⁶⁶⁾ 내유모세포에서 heat shock protein 70 의 과발현을 유도하는 데에도 성공적인 결과를 보이는 등⁶⁷⁾ 인간 내이세포를 표적으로 한 유전자 치료에 한걸음 가까이 다가가는데 큰 역할을 하였다.

Adeno-associated virus(AAV)는 Parvoviridae family에 속하며, 복제가 불가능한 작은 adenovirus-dependent virus로 유전자 전달을 위한 바이러스성 벡터로 큰 주목을 받고 있다. AAV 유전자는 4.8 kb이고, 숙주 세포내에서 캡시드를 녹인 뒤 고분자량의 circular concatemer를 형성하여 안정된 형태의 episome 형태로 존재하거나, 숙주 세포의 유전체에 통합될 수도 있다.⁶⁸⁾ AAV는 질병을 유발하지는 않지만 일부 인구집단에서는 약 50%까지 면역력이 있을 정도로 소아기에 흔히 감염되므로^69,70) 면역력이 있을 경우 AAV를 이용한 임상시험에서 배제되게 되는데, 이는 AAV 연구결과를 왜곡할 수 있는 여지가 있다.⁷¹⁾ 인간에서 발견되는 AAV 혈청형은 12가지이며, in vivo 연구에서 내이에서는 AAV 1-4, 7, 8이 발견되고, 내유모세포에서는 AAV1-3, 5, 6, 8이, 외유모세포와 지지세포에는 AAV1이 감염되기도 하였다.^72,73) 또한 Claudius 세포, spiral ganglion과 inner sulcus 세포들에서 AAV5가 발견되었고,⁷⁴⁷⁵⁾ 마우스 내, 외유모 세포로 분화되는 progenitor 세포에 AAV2/1이 형질도입을 일으키거나,⁵⁷⁾ 기니피그의 내유모세포에 AAV2/2가 효과적이었다는 보고가 있다.⁷⁶⁾ 하지만 가장 큰 단점인 AAV의 4.8 kb 밖에 되지 않는 작은 적재 용량을 극복하기 위한 해결책으로 split AAV 벡터를 이용하는 방법이 연구되고 있다. 먼저 AAV의 concatamerization을 이용하는데 5’ 방향 반쪽 transgene의 3’ 끝에 splicing donor를 붙이고, 3’ 방향 반쪽 transgene의 5’ 끝에 splicing acceptor를 붙여 2개의 반쪽짜리 transgene이 담긴 concatemer를 transplicing시켜 최종 messenger RNA(mRNA)를 만들고, 하나의 단백을 합성하는 방법이 있다. 이러한 dual gene 수송법은 4.8 kb보다 큰 유전체를 전달하기 위해 여러 동물모델에서 성공적이었으나,^77,78 내이 유전자 치료에는 적용되지 않았다. 두번째 방법으로 intein-mediated protein splicing을 이용하는데, 표적단백의 N-terminal과 C-terminal 조각에 각각 trans-acting split-intein을 붙여 인코딩한 후 하나의 세포에 두 종류 transgene을 주입하고, 두 intein을 포함한 단백이 각각 발현되면 하나의 intein assembly를 만들며, 두 표적 단백질 조각을 정확하게 ligation 한 뒤 intein assembly는 자체적으로 splicing 되게 된다.⁷⁹⁾ 이런 방법으로 Duchenne muscular dystrophy 마우스 모델에서 Becker-form dystrophin의 split-gene이 AAV1 벡터를 이용해 효과적으로 발현되었고,⁸⁰⁾ 2개의 AAV 벡터를 이용한 split Cas9 단백의 세포 배양도 보고되었다.⁸¹⁾ 최근 두 연구에서 otoferlin KO 마우스에 otoferlin cDNA를 운반하기 위해 분할 바이러스 벡터를 이용하여 표적 내유모세모의 절반 이상에서 dual transduction이 이루어졌고, 단백 발현이 wild-type의 30%까지 회복되었으며 청각기능의 일부도 회복되었다.^82,83

Anc80L65는 AAV로부터 인공적으로 합성된 벡터로 AAV 진화적 조상의 combinatorial library(Anc80Lib)를 효과적으로 대표하는데, 생산성 면에서 AAV2보다는 효율적이나, AAV8보다는 저조한 편으로 실제 임상에 적용하기 위해서는 제약이 있다.⁷¹⁾ 하지만 Anc80L65는 murine 모델의 근육, 망막, 간조직에서 형질 도입 능력이 가장 강력한 AAV8보다 높은 효과를 보였고, 내이 유모세포의 형질 도입에도 뛰어난 효율성을 보였다.⁸⁴⁾ 출생초기 쥐의 정원창을 통한 전달시 다른 AAV serotype에 비교해 2~3배 적은 용량만으로도 90%까지 내, 외유모세포에 형질이 전달되었다. 성인 쥐에서는 canalostomy로 전달시에는 비록 외유모세포에는 도달이 적었으나, 내유모세포의 거의 100%에서 형질 전달이 되어 Anc80L65는 현재까지 내이의 유모세포에 형질 도입율이 가장 높은 벡터이다.⁸⁵⁾ 또한 와우의 유모세포뿐 아니라, 전정기관의 type I과 type II 유모세포에도 형질 전달이 성공적으로 나타났으며, 안정성 측면에서도 쥐의 ABR, DPOAE, 전정기능에 장애를 일으키지 않아, 비록 대형 동물에서도 이러한 효과가 입증되어야 하겠지만, 내이의 유전자 치료에 매우 유용할 것으로 기대를 모으고 있다.⁸⁴⁾

AAV2.7m8도 AAV로부터 인공적으로 합성된 벡터이며, AAV2 캡시드 단백 서열의 588번째에 10개의 아미노산이 삽입되어 제조되었다. 신생아 쥐의 후반고리관을 통해 벡터를 전달후 4주째에 와우의 전체에 걸쳐 내유모세포의 약 84%, 외유모세포의 약 83%에서 전달율을 보여 매우 효율적인 벡터중 하나이다.⁸⁶⁾ 전정기관의 전달율은 상대적으로 낮았으나, Anc80L65와 마찬가지로 ABR역치, 전정기능에 장애를 일으키지는 않았다. 벡터의 전달 경로나 사용된 promoter의 종류에 따라 전달율은 차이를 보일 수 있으나, AAV2.7m8은 전정기관을 보존하며, 와우에 특이적인 형질 전달시 유용하게 쓰일 수 있겠다.

Exo-AAV(Exosome-Associated AAV)는 바이러스를 exosome에 결합시켜 AAV의 형질 도입율을 높인 벡터이다. Exosome은 세포간 통신의 주요한 구성요소중 하나로 나노미터 크기의 세포막의 분비소포이다. In vitro에서 내유모세포의 65%, 외유모세포의 50%의 전달율이 나타났고, in vivo에서는 정원창이나 cochleostomy를 통해 내유모세포의 95%, 외유모세포의 50%의 전달율이 나타났으며, 마우스모델에서 청력과 전정기능을 개선하였다.⁸⁷⁾ 하지만 exosome은 RNA를 포함한 여러 단백질과 핵산을 운반하고, 완전히 밝혀지지는 않았으나 여기에는 세포간 통신에 주요한 역할을 하는 물질을 포함하며, 결국 표적 세포의 기능이나 전사체의 수정, 또는 암을 포함한 신호전달 체계의 비정상적 활성화를 일으킬 수도 있다.⁸⁸⁾ 따라서 AAV 벡터와 함께 적용을 위해서는 인공합성의 exosome 이용이 적합할 수 있다.⁸⁹⁾

비바이러스성 벡터로는 cationic liposome, dendrimer, nonliposomic polymer 등이 있다. 이러한 인공 화합물은 비생물학적 환경에서 제조할 수 있고, 비면역원성을 보이며 생물학적으로 안전하다. 바이러스벡터 만큼 널리 사용되지는 않으나, 바이러스성 벡터보다 우수한 측면도 존재한다.

Cationic bilayer liposome(CL)은 음전하를 띄는 DNA와 RNA를 세포내로 전달하는데 효과적으로 세포외 효소나 항체로부터 수화물을 안정적으로 보호한다. 또한 양전하를 띄기 때문에 음전하인 세포의 원형질막에 반하여 endocytosis를 개시하고, endosome으로부터 내용물을 유리시키는데 효과적이다. 낮은 세포독성을 보이는 다양한 양이온성 지질 제형이 개발되어 왔는데, 흔히 쓰이는 Lipofectamine 2000은 내유모세포에 세포독성이 있는 것으로 알려져 핵산을 모세포에 전달하는 목적으로는 널리 쓰이지 않는다.⁹⁰⁾ 반면 RNAiMAX 와 Lipofectamine 2000은 유전자 조작 단백인 Cre recombinase 및 Cas9:sgRNA 복합체를 외유모 세포에 전달하는데 사용되었고, Lipofectamine 2000이 가장 효율적이었는데, 비록 일부 세포 손실이 관찰되었으나, 외유모세포의 90%에서 Cre-mediated 재조합 및 20%에서 Cas9-mediated 유전자 변형이 일어났다.⁹¹⁾ Cas9를 이용할 때 동일한 서열을 갖는 유전체 부위를 반복 조작하여 off target effect를 일으킬 수 있으므로 장기적으로 발현시키는 데에 무리가 있다는 점에서, 유전자 편집시 단백을 암호화하는 DNA를 전달하기보다는 비바이러스성 벡터를 사용한 단백 전달이 더 유리할 수 있다.

Dendrimer는 central core에서 분지하는 monomeric subunit 형태의 가지가 많이 달린 nanometer 크기의 물질로 그 core 및 분지하는 monomer, 표면의 화학물질의 조합을 통해 다양한 크기와 구조의 핵산에 적절히 결합할 수 있게 된다.⁹²⁾ DNA-dendrimer superfect나 hyperbranched polylysine nanoparticle 복합체를 정원창에 주사하여 코르티기관내 세포들에 전달이 성공적으로 보고되었다.

Polyamine nonliposomal transfection agent는 핵산, 히스톤 단백과 같은 비독성 세포단백, 소량의 polyamine polymer 복합체를 기반으로 한다. 그중 하나인 Mirus TransIT는 유전자를 Rosenthal’s canal과 내유모세포에 전달하였다.⁹³⁾ 하지만 linear polyethylenimine nanoparticles⁹⁴⁾나 poly(lactic-co-glycolic) acid nanoparticle⁹⁵⁾은 내이 세포독성을 보이는 것으로 나타났다.

운반체를 매개로 한 유전자 전달방법 외에도 전기장을 매개로 한 DNA 전달(electroporation)도 시도되고 있다. 와우에 삽입된 전극에서 발생한 고압 전기장은 일시적으로 세포막을 파괴하여 세포외부의 DNA가 세포내로 들어갈 수 있는 구멍을 만든다. Electroporation 은 높은 효율과 면역반응이 없다는 장점이 있으나, 와우내 전극을 삽입하고 전기 자극시 발생하는 조직 손상의 단점이 있다. 동물실험에서 Neurog1, NeuroD1, Sox2 전사인자의 이소성 발현에 효과적이었고, 출생 초기 와우의 nonsensory region에서 신경세포의 형성을 유발함이 관찰되었다.⁹⁶⁾ 또한 인공와우 전극을 이용한 Close-field electroporation으로 기니피그에서 BDNF를 코딩하는 naked DNA를 외림프 공간내의 mesenchymal 세포로 전달하여 위축된 spiral ganglion의 재생이 시도되었다.⁹⁷⁾

유전자 치료의 목적지인 와우, 반고리관, 이석기관은 결국 측두골의 골성 미로내에 갇혀 있는데, 특히 림프순환도 최소화되어 있고, 혈액-미로장벽에 의해 혈액과도 분리되어 있어 in vivo 실험시 신생아 쥐에서만 치료물질의 전달이 효과적이라는 한계를 보인다.⁹⁸⁾ 결국 유전자치료에 적절한 바이러스 역가를 도달시키기 위해 벡터를 내이에 직접 국소주입 하게 되는데, 그 방법은 다음과 같다.

정원창막은 3개의 층으로 구성되어 있고, 외림프 공간으로 통하는 입구로 인공와우 전극을 넣는 곳이기도 하며, 현재까지 동물모델에서 가장 많이 사용되는 접근법이다. 외림프 누출로 인한 청력 손실에 대한 우려가 있으나, 근막 등의 조직으로 막아 이를 예방할 수 있다. 다만 와우의 전체에 바이러스 벡터를 골고루 분포시키기가 어려워 결과적으로 형질이 도입된 마우스에서는 base to apex로 전달의 농도차가 발생하게 된다.⁹⁹⁾

Kawamoto 등이 개발한 후반고리관을 개창하고, cannula를 공통각 방향으로 향하여 벡터를 주입하는 방법이다.¹⁰⁰⁾ 청력의 손상이 적지만 벡터의 전달이 와우에 충분히 도달하지 못할 수도 있다. Cannula의 방향을 ampulla 쪽으로 향하는 방법으로 수정되어 시행되기도 한다.⁸⁵⁾ 최근 이러한 접근법을 통해 KCNE1 돌연변이 마우스에서 유전자 치료의 높은 효율을 확인한 바 있다.¹⁰¹⁾

와우의 기저부분을 개창하여 유전자를 scala media의 내림프에 직접 전달한다. 청력을 악화시킬 수 있다는 단점이 있는데, 연구자에 따라 그 보고가 다르게 나타나고 있다. Chien 등은 AAV8 벡터를 정원창막과 와우개창을 통해 전달 후 효과를 비교하였는데, 와우개창시 청력손실이 나타났으나 전달율은 유사하였다.¹⁰²⁾ 대조적으로 Kilpatrick 등은 AAV8을 이용한 전달시 와우개창술에서 전달율이 높았고, 32 kHz 이상 고주파에서 청력 손상이 간소하게 나타났으나, 수술 후 1개월 후에는 32 kHz 미만의 중, 저주파수에서 청력에 영향을 주지 않았다.¹⁰³⁾ 다만, 이 방법은 기술적으로 어려워 줄기세포 이식이나 유모세포 재생시 적합한 방법이 될 것으로 보인다.

성인 마우스에서 정원창막을 통한 전달은 base to apex의 농도차를 유발하기 때문에 이를 극복하기 위해 주입량을 늘리게 된다면 이로 인한 청력 손실이 발생할 수 있다.⁹⁹⁾ 정원창막과 후반고리관을 동시에 개창함으로써 개창부위가 통풍구 역할을 하여 와우의 전구간에 걸쳐 주입된 벡터가 고르게 분포시킬 수 있다. 다만 이로 인한 일시적인 전정기능의 저하가 유발될 수 있고, 수술 후 다음날까지 쥐에서 안진이 관찰되었으나, 이후 비정상적인 회전행동은 유발되지 않았다.

유전성 난청을 일으키는 유전자는 300여 가지 이상이 발견되었고,³⁾ 각각 유전 방식이 다르며, 표현형의 발생과 진행속도가 다르게 나타난다. 많은 난청 유전자가 내이의 발생, 구조, 기능에 중요한 역할을 담당하지만, 유전자 치료의 훌륭한 표적이 되지는 못하는 경우가 대부분이나, 일시적 발현을 보이거나 세포 생존에 필수적이며, 발생의 특정한 시기에 핵심 역할을 하는 몇몇 유전자들이 유전자 치료 개발을 위한 동물연구의 표적이 되었다.

Vglut3(SLC17A8) 변이는 다양한 난청 인구 집단에서 약 1.6%의 원인이 되며, 상염색체 우성으로 유전된다.¹⁴⁾ Vglut3 유전자는 글루타메이트를 synaptic vesicle로 수송하는데 필수적인 vesicular glutamate transporter(VGLUT3)를 코딩하고, 인간에서 Vglut3의 missense 변이는 진행성 고주파성 난청(DFNA25)을 유발한다.¹⁰⁴⁾Vglut3 KO 마우스의 와우에 Vglut3 cDNA를 AAV를 매개로 전달하였던 연구는 최초의 성공적인 포유류 유모세포의 유전자 치료였다.⁷³⁾ 이들은 AAV2/1을 이용해 P1~12일의 마우스 와우에 유전자를 주입하여 ABR과 acoustic startle reflex가 2주 이내에 회복되었음을 보였고, 내유모 세포의 afferent ribbon synapse의 형태도 부분회복을 보였다. 다만 이때 사용한 벡터는 광범위한 활성을 갖는 promoter를 포함하였음에도 불구하고, 도입된 유전자는 내유모세포에서만 발현되었다.

TMC1 변이는 난청 인구집단의 약 2.3%에서 발생하는 것으로 보고되었고, 일부 집단에서는 유전성 난청의 4~8%를 차지하기도 하며, 상염색체 우성(DFNA36) 또는 상염색체 열성(DFNB7/11)으로 유전된다.^14,105)TMC1 유전자는 유모세포 다발의 apex에 위치하며, transduction에 관여하는 TMC1 단백을 코딩한다.¹⁰⁶⁾ 열성 loss of function 모델인 TMC1 KO 마우스와 인간 DFNA36 모델인 베토벤 마우스(Bth), 두 종류의 마우스 모델에서 AAV2/1를 이용한 유전자 전달 연구가 보고되었다.⁷²⁾ KO 모델에서 P0-P2에 AAV2/1-TMC1 벡터를 주입시 내유모세포에서 mechanotransduction 이 80~90% 회복되었으나, in vitro에서는 외유모세포 에서도 발현이 되었음에도 불구하고, DPOAE가 회복되지 않았다. Bth 마우스에서 AAV2/1-TMC2 벡터를 전달했을 때 내유모세포의 청각 기능과 생존이 관찰되었고, 이를 통해 TMC1과 TMC2 유전자가 서로 중복되는 기능을 갖거나 부분적으로 대체가 가능하다는 가설을 뒷받침하였다. 다만 startle response가 회복되지는 않았으며, dominant variant의 형질을 전환하기 위한 다른 방법이 필요할 수 있음을 시사한다. Shibata 등은 Bth 마우스의 형질을 억제하기 위해 miRNA를 AAV 벡터를 이용해 초기 발달단계 마우스에 단일 와우내 주입하였다.⁴³⁾ 이는 대조군에 비해 유모세포 생존율이 높았고, 난청의 발생을 35주까지 늦추었다. Vlut3 유전자 전달로 난청 발현이 억제되었던 마우스가 7주차부터 난청이 다시 진행되었음을 고려할 때⁷³⁾ 상대적으로 장시간 효과가 유지되었음을 알 수 있다. 최근 Gao 등은 신생아 Bth 마우스의 와우로 CRISPR-Cas9 전달을 통해 청각기능이 호전시켰는데, 특히 cationic lipid nanoparticle 인 Lipofectamine 2000을 결합하여 세포 투과성을 향상시켰다.¹⁰⁷⁾ 이 연구는 최초로 CRISPR/Cas9 을 상염색체 우성형질의 난청을 교정하기 위해 도입하였다.

WHRN은 증후군성 난청을 보이는 Usher type 2의 원인 유전자중 하나로, 상염색체 열성으로 유전되며 난청 집단의 0.5%에서 발견된다.¹⁴⁾ 유모세포 내의 cytoskeletal 단백중 하나인 Whirlin을 코딩하는데, 길이가 다른 두종류의 isoform이 있고, stereocilia의 다른 부위에서 발현되며, 변이로 인해 두 isoform이 부족해지면 stereocilia의 길이가 짧아져 고심도 난청을 유발한다.¹⁰⁸⁾ 이 단백은 다른 3종류 단백(USH2A, GPR98, PDZD7)과 tetramer complex를 이뤄 stereocilia의 ankle link에 위치하고, myosin 15a 단백질과 상호작용하여 stereocilia의 길이를 연장하는 기능을 한다.¹⁰⁹⁾ KO 마우스에서 AAV8-whirlin cDNA 처리된 마우스는 stereocilia의 형태는 회복했으나, 재생된 stereocilia의 길이나 수, 낮은 바이러스 감염률, isoform의 불균일한 발현으로 정상적인 청각기능을 회복하지는 못했다.¹¹⁰⁾ 하지만 후속연구에서 후반고리관을 통한 AAV8-whirlin 주입 후 청력 및 전정 기능의 일부가 회복되었음이 보고되어, 두 isoform 모두로 vector의 전달효율을 높인다면 기능회복을 더 높일 수 있을 것으로 보인다.¹¹¹⁾

USH1C 변이는 선천성 난청, 전정 기능 저하, 망막 색소병증을 주증상으로 하는 상염색체 열성유전 형태의 Usher 증후군 type 1을 일으키는데, 변이의 종류, 즉 point mutation, exon의 expansion, multiexon continuous deletion에 해당하는지에 따라 표현형의 정도가 다르게 나타난다.^46,112) 난청집단에서는 약 0.3%에서 발생하는 것이 보고되었다.¹⁴⁾ 마우스 내이의 유모세포에서 발현이 되고, harmonin 단백을 코딩하며, 3개의 isoform을 만든다. Harmonin-b는 stereocilia에 존재하여 sans protein을 통해 myosin 7a와 안정한 3차 복합체를 형성하고, 또한 cadherin-23 및 procadherin-15 와도 상호작용한다.¹¹³⁾ 이를 통해 stereocilia의 발달 및 정렬상태의 유지를 촉진하는 scaffold를 형성하는데 harmonin 단백의 이상은 모세포 다발의 구조를 망가트려 난청을 초래한다. Harmonin-a는 유모세포 시냅스부위에 위치하여 칼슘채널을 유지시켜 synaptic transmission에 관여하는 것으로 여겨진다. Lentz 등은 마우스모델에서 c.216G9A 변이가 일으키는 splicing defect를 antisense oligonucleotide(ASO)를 복강 내 단일 주사하여 교정하였다.⁴⁶⁾ ASO가 생체 내에서 흡수되는데에는 장벽이 존재하지만, 몇 가지 화합물을 붙여 endocytosis 시 세포 친화성을 높일 수 있게 된다.¹¹⁴⁾ ASO를 주사한 쥐에서 harmonin 발현이 증가하였고, stereocilla의 배열이 호전되었으며, 저주파 청력(8-16 kHz) 및 전정기능을 향상시켰다. P13까지는 전정기능이 개선이 관찰되었으나, P16에는 전정기능의 악화가 시작된 반면, 청력 개선 효과는 1회 투약 이후 6개월까지 지속되었다. 후속연구에서는 동일한 c.216G9A 모델에서 출생초기 두 형태의 harmonin 단백이 AAV2/Anc80 벡터 및 CMV promoter 조절을 통해 정원창을 거쳐 내이로 전달되어 유전자 대체가 성공적으로 이루어졌다.¹¹⁵⁾ 주입 후 P0-1 시기에는 청각, 전정 기능 및 mechanotransduction을 상당히 회복하여, 일부 쥐에서 ABR 역치가 wild type과 비슷한 정도까지 호전되었고, 6주까지 유모세포 손상은 매우 감소한 상태로 유지되었으며, 정상 계단형태의 hair bundle이 관찰되었다.

USH3A는 일반적으로 언어발달 후에 나타나는 진행성 난청, 실명, 전정기능 저하를 증상으로 하는 Usher 증후군 type 3의 유일한 원인 유전자이다.¹¹⁶⁾USH3A는 코르티기관과 spiral ganglion에서 발현되며, Clarin-1을 코딩하고, 이 단백은 mechanotransduction과 presynaptic ribbon assembly의 조절자 역할을 한다.¹¹⁷⁾ György 등은 AAV9 캡시드 변이체인 PHP.B를 이용해 Clarin-1을 코딩하는 유전자를 신생아쥐에 전달하여 청력을 회복하였고, 최초로 영장류(Cynomolgus Monkey)에 AAV9-PHP.B-GFP를 정원창에 1회 주입하여 7주 뒤 벡터가 코르티기관, spiral ligament, limbus, stria vascularis에서 발현된 것을 관찰하였다. 특히 내, 외유모세포 각각에 92%의 전달율을 보였다. 다만 두번째 영장류 실험에서는 벡터의 주입량을 줄였는데, 이때에는 내이의 벡터의 형질 전달이 관찰되지 않아, 대형 포유류에서 정원창을 통한 주입법 및 전달 농도에 따른 전달율에 대한 추가적인 연구가 필요하다.

GJB2 변이는 전세계적으로 유전성 난청의 가장 흔한 원인이며, 상염색체 우성(DFNA1) 또는 열성(DFNB1) 형태로 유전되고, 난청집단에서 약 21.5% 원인을 차지하는 것으로 보고되었다. GJB2 유전자는 transmembrane protein인 Cx26을 코딩하여 세포사이 물질 교환기능을 하는데, 이 단백은 코르티기관과 stria vascularis의 세포들을 연결하는 역할을 하는 지지세포에서 많이 발현된다.¹¹⁸⁾ 높은 유병율을 보이는 GJB2 변이는 유전자 치료의 잠재적인 목표중 하나로 여겨지나, 이런 큰 관심에도 불구하고 GJB2 변이의 germline mutation의 경우 자궁내 치사를 보여 연구가 매우 제한적이었다. Maeda 등은 RNAi를 이용해 dominant negative mutation인 p.R75W의 발현을 억제하였다. 먼저 마우스 체내로 GJB2-R75W-eGFP를 발현하는 플라스미드를 형질감염시켜 dominant negative 형태의 청력손실을 유발하고, 이후 p.R75W 변이를 침묵시키는 RNAi를 전달하여 교정하였다.¹¹⁹⁾ Yu 등은 AAV1 벡터를 이용해 GJB2 결핍 와우에 GJB2 서열을 전달하여 세포사멸과 spiral ganglion neuron 퇴화를 감소시켰으나, 청각 기능을 호전시키지는 못했는데, 이는 AAV1의 전달 효율이 높지 않고 기능적 회복을 보이는 시기 이후(P0-1)에 주입하였기 때문으로 여겨진다.¹²⁰⁾ Iizuka 등은 조건부 GJB2 KO 마우스에 AAV5를 이용해 주산기 주입을 하여 일부 와우내 구조와 ABR 역치를 호전시켰다.¹²¹⁾ Takada 등은 adenovirus를 이용해 BDNF를 GJB2 KO 마우스의 와우 기저부 Rosenthal’s canal에 전달하여 신경기능을 호전시키기도 하였다.¹²²⁾